Prokaryotlarda Hücre Savunması ve Evrimi: CRISPR-Cas Sistemi

Yazdır Prokaryotlarda Hücre Savunması ve Evrimi: CRISPR-Cas Sistemi
Belki de mikrobiyoloji alanına yönelmiş bir öğrenci olmamdan kaynaklı, “Doğa bir savaş alanıdır.” sözü bana çayırlarda koşturan aslan ve geyiklerden çok bağışıklık sistemini hatırlatıyor. Moleküler düzeydeki evrimsel savaşın en serti patojenler (yani hastalık yapan organizmalar) ile konak canlıların bağışıklık sistemi arasında gerçekleşmektedir desek abartmış olmayız sanırım. Birlikte evrimin en güzel örneklerini görebileceğimiz bu çekişme aslında temel olarak bir organizmanın “ben ve diğerleri” ayrımını yapabilmesine dayanmakta. Patojenler için evrimsel başarı ise bu ayrımdan kaçabilmelerine bağlı.

Modern tıbbın önlenebilir hastalıklara karşı bağışıklık sistemimiz kadar iyi bir iş çıkardığını reddedemeyiz. Tedavi ve aşı yöntemleri sayesinde (ve tabi ki gıda, temizlik gibi birçok faktörün de birleşimi ile) insan ömrü 1900’lerin başından bu yana iki katına çıkmıştır. Fakat elbette bu bağışıklık sistemlerini araştırmayı bir kenara bırakacağımız anlamına gelmiyor. Henüz çare bekleyen birçok hastalığın yanında aslında bu sistemler birazdan da anlatmaya çalışacağım gibi hiç tahmin edemeyeceğimiz teknolojik yeniliklere yol açabilir ki zaten temel bilim çalışmalarının tamamı böyle değil midir?



Bağışıklık Sistemini Tanıyalım

Öncelikle kısaca bağışıklık sistemini tanıtmak faydalı olur. Bahsettiğimiz gibi bağışıklık sistemi bir organizmanın kendi hücrelerini yabancı hücreler ve maddelerden ayırabilmesi ve bunları etkisiz hale getirebilmesi adına özelleşmiş hücre, protein ve etki mekanizmalarının tümüne verilen addır. Bu sistemi temel olarak ikiye ayırabiliriz; doğuştan gelen bağışıklık ve edinilmiş bağışıklık. Doğuştan gelen bağışıklık evrimsel olarak daha eskidir ve tüm canlılarda bulunur. Bu sistemin elemanları, bakterilerde işgalci virüs DNA’larını kesen nükleaz enzimleri olabildiği gibi bizlerde vücuda giren yabancı maddeye ilk tepkiyi veren fagositler, mast hücreleri gibi hücreler de olabilir. Bu yazının esas konusu ve üzerinde daha detaylı duracağımız sistem ise edinilmiş bağışıklık sistemidir.

Edinilmiş bağışıklık sistemi üzerine küçük bir araştırma yapmak bile insanı heyecanlandırmaya yeter aslında. Bu sistemin özelliği ileri düzeyde özelleşmiş, neredeyse her patojeni tanıyabilecek potansiyele sahip hücrelerden ve bir sefer tanıdığı patojeni uzun zaman hafızasında tutabilecek (mekanik bir hafızadan bahsediyoruz) etki sistemlerinden oluşmasıdır. Bazı aşıların insan ömrü boyunca tek bir sefer yapılmasının yeterli olmasının sebebi de bu hafızadır. Edinilmiş bağışıklığın omurgalılara has bir sistem olduğu söylese de diğer canlılarda da bu tür benzer sistemlerin ipuçlarını görebiliyoruz, özellikle birazdan bahsedeceğimiz gibi.

İnsandaki ve daha genel anlamda omurgalılardaki edinilmiş bağışıklık sistemini biraz detaylandıracak olursak T ve B hücrelerinden bahsetmemiz gerekli. Bu hücreler birbirlerine oldukça benzeseler de bir enfeksiyon durumunda aktif hale geçmelerinin ardından önemli farklılıklar göstermeye başlarlar. T hücreleri patojen ile girdikleri doğrudan hücre etkileşimi ile savunmada görev alırlar. Kimi T hücreleri yardımcı olarak adlandırılır ve diğer savunma hücrelerinin enfekte olmuş bölgeye çağırılmasında görev alır, kimileri ise katil olarak adlandırılır ve bakterilerin veya enfekte olmuş insan hücrelerinin yok edilmesini sağlar. B hücreleri ise mutlaka bir şekilde duymuş olduğunuz antikor denilen maddelerin üretiminde temel görevi üstlenen hücrelerdir. Antikorlar Y şeklindeki proteinlerdir ve en önemli özelliği patojenlerin tanınmasına olanak sağlaması ve hatta bazı durumlarda bu patojenleri öldürebilmesidir. Bu noktada biraz teknik ayrıntıya girmek sistemin heyecan verici yanını anlamamıza yardım edecek. Antikorlar, antijen denilen ve bakteri ve virüslerin yüzeyinde bulunan maddelere bağlanarak işaretleme yaparlar. Antijenler özel maddeler olmak zorunda değildir, yani eğer bir antikor bakterinin yüzeyinde, bakteriye özgü herhangi bir proteine bağlanıyorsa artık o protein antijen olarak adlandırılır. Burada “herhangi” kelimesi önemlidir çünkü antikorların “herhangi” bir yabancı proteini tanıyabilecek çeşitlilikte olması gerekir. Bu çeşitliliğin kaynağı ise –evet, doğru tahmin ettiniz– mutasyonlardır. Bir B hücresinin olgunlaşması aslında bize evrim sürecinin minik bir sunumunu verir diyebiliriz. Olgunlaşmamış B hücrelerinin tamamı, diğer vücut hücrelerimizle birlikte aynı genetik yapıya sahiptir. Fakat olgunlaşma sürecinde özellikle antikorların antijen ile etkileşen kısımlarının üretiminden sorumlu gen bölgeleri yani VDJ genleri önemli değişiklikler yaşar. Bu değişimlerden biri somatik hipermutasyon dediğimiz süreçtir. Antikorların antijen ile bağ kurabilmesinin temeli, 3 boyutlu şekillerinin birbirlerine olan uyumudur, bunu bir anahtar-kilit analojisi ile anlamaya çalışmak en kolayıdır. İşte somatik hipermutasyon da bir antikorun antijen ile bağ kuran aktif bölgesini (yani bizim anahtarımızın tırtıklı yüzeyini) rasgele bir şekilde değiştirmeye yarar. İstatistiksel olarak somatik hipermutasyona maruz kalan bölgelerdeki mutasyon oranı, vücudumuzun diğer bölgelerine oranla 1.000.000 kat daha fazladır ki bu da her yeni B hücresinin birkaç adet mutasyon taşıdığı anlamına gelir. Bir diğer değişim ise VDJ rekombinasyonları veya somatik rekombinasyon denilen süreçtir. VDJ genleri olgunlaşmamış bir B hücresinde çok çeşitli sayıda bulunurken (VVVVV DDDD JJJJJJ gibi) hücrenin olgunlaşması sırasında rastgele bir şekilde seçilerek sayıları tek bir antikor üretebilecek kadar azaltılır (VVDJ). Bu iki süreç sonunda ise her bir olgunlaşmış B hücresinin farklı bir antikor üretebildiği bir hücre havuzu elde etmiş oluruz. Elimizdeki bu çeşitliliğin üzerindeki seçilim baskısı ise antijenler tarafından oluşturulur. Ürettiği antikor, bir antijene bağlanabilen B hücreleri seçilir ve bağışıklık hafızası dediğimiz mekanizma ile korunurlar. Aynı patojen ile tekrar enfeksiyon durumunda hızlı bir şekilde çoğaltılarak çok daha çabuk ve etkili tepki verilmesini sağlarlar. Diğer B hücreleri ise ömürlerini tamamlayana kadar vücutta dolaştıktan sonra yok edilirler. İşte size ekolojik anlamda kullandığımızın aynısı olmasa da sadece en uyumluların hayatta kaldığı bir evrimsel süreç örneği. Tabi burada bu süreçlerin somatik olduğunu yani vücut hücrelerinde gerçekleştiğini ve yavrulara aktarılmadığını belirtmek gerekir. Zaten bu sebeple edinilmiş bağışıklık sistemi, canlının ömrü boyunca karşılaştığı patojenlere karşı direnç sağlar.




Prokaryotların Dünyasına Yolculuk

Şimdi gelin üzerinde konuştuğumuz boyutu değiştirelim ve prokaryotların yani zarlı organel bulundurmayan tek hücreli canlıların dünyasına girelim. Evrimsel olarak canlılığı en temel düzeyde 3 gruba ayırırız. Bunlardan biri ökaryotlardır ki çevrenizde görebildiğiniz canlıların tamamı bu gruba dâhildir. Bir diğeri bakterilerdir, birçoğumuz bakterilere de aşinayız. Fakat 3. grup olan arkeleri çok tanıdığımız söylenemez. Bu aslında doğal çünkü uzun bir süre boyunca arkeler bakteriler grubuna dâhil edilmişti. Ta ki 1977 yılında, ünlü mikrobiyolog Carl Woose 16S ribozomal RNA benzerliklerini incelemesinin ardından onları ayrı bir grup olarak tanımlayana kadar. Geçen 35 yıl boyunca arkeler üzerinde birçok çalışma yapıldı ve bugün Carl Woose’un önerdiği 3 gruplu sınıflandırma sisteminin oldukça tutarlı olduğunu biliyoruz. Daha da önemlisi evrimsel açıdan arkeler ve ökaryotların birbirlerine bakterilerden daha yakın olduğunu da biliyoruz. Şöyle ki her ne kadar arkeler, prokaryot canlılar olsa da DNA eşleme, protein sentezi gibi işlevleri gerçekleştirirken kullandıkları proteinler bakterilerden çok ökaryotların proteinlerine benzemekte. Hatta bu benzerlik ve arkelerin etkili DNA tamir sistemlerinden faydalanarak bu canlıların kanser araştırmalarında kullanılması ile ilgili çalışmalar yürütülmekte.


Prokaryotlarda Hücre Savunması

Bu ön bilgiler eşliğinde daha fazla dağılmadan konumuza dönelim. Patojenlerin oluşturduğu sıkıntılar maalesef tek hücrelilerin dünyasını da sarmış durumda. İster insan bağırsağında yaşayan bir bakteri olun ister 75 derecede aşırı asidik ortamda yaşayan bir arke, başınız asla virüslerden kurtulmaz. Bu da doğal olarak tek hücreli canlıların da virüslere karşı bir savunma mekanizmasına sahip olmasını zorunlu kılar. Virüslerin etki mekanizmasını kısaca şöyle özetleyebiliriz: Virüslerin yüzey proteinlerini kullanarak hücreye tutunması, kendi genetik materyalini konak hücrenin içine aktarması, bu genetik materyalin, hücrenin protein sistemini kullanarak kendini eşlemesi ve sonunda oluşan çok sayıda yeni virüs sebebi ile konak hücrenin patlaması ve virüslerin yeni konaklar bulmak üzere dağılması. Bakteri ve arkelerin doğuştan gelen bağışıklık sistemi genellikle virüslerin tutunduğu reseptörlerin yapısını değiştirmek ve restriksiyon – modifikasyon enzimleri yardımı ile hücrenin DNA’sına girmiş virüs DNA’sını kesmek şeklinde işliyor. Ancak son zamanlarda yapılan çalışmalar ile bu canlıların bir de edinilmiş bağışıklık mekanizmasına sahip olduğu ortaya çıktı. Evet, yanlış duymadınız. Sadece omurgalılara özgü olduğunu düşündüğümüz edinilmiş bağışıklık sistemi, talihsiz bir şekilde “ilkel” olarak nitelendirdiğimiz prokaryotlarda da bulundu.

Bilinen arkelerin tamamına yakınında ve bakterilerin de yarısında bulunan bu sistem CRISPR-Cas sistemi olarak adlandırılıyor. CRISPR’ın açılımı “clustered regularly interspaced palindromic repeats”. Henüz bir Türkçe karşılığına denk gelmedim, o sebeple ilk çeviri önerisini burada sunup “düzenli aralıklarla bölünmüş palindromik tekrar kümeleri” diyebilirim. CRISPR denildiğinde kastedilen teknik anlamda canlının DNA dizisi üzerinde, CRISPR lokusunu tanımlayan gen dizileridir. Bunlar cas genleri, onu takip eden lider dizi ve sonrasında gelen tekrar (repeat) ve aralık (spacer) dizileridir. Tekrar dizileri bir canlı için tamamen aynı olmakla birlikte bu tekrarların arasındaki aralık dizileri birbirinden farklılık göstermektedir. Cas ise bu bağışıklık sisteminde görev alan proteinlerin genel adıdır.



CRISPR kümelerinin varlığı 1980’lerden beri bilinse de canlının savunma mekanizmasındaki rolü görece yeni kanıtlanmış durumda. Bu çıkarıma giden araştırmalar ise 2005 yılında CRISPR genleri üzerine çalışan 3 farklı grubun keşfi ile başladı. Bu grupların keşfettiği şey, CRISPR kümelerinde bulunan aralık genlerinin, o canlıyı enfekte eden bazı virüsler ile aynı diziye sahip olmasıydı. Ayrıca bir virüs DNA’sı ile aynı diziye sahip aralık genine sahip olmak o virüse karşı bir direnç veriyordu. Elbette buradan CRISPR sisteminin nükleik asit temelli bir bağışıklık mekanizması olabileceği hipotezi ortaya çıktı ve yapılan araştırmalar sonucunda bugün bu hipotezin büyük oranda doğrulanmış olduğunu söyleyebiliriz.

Genel hatları ile sistemi şu şekilde özetleyebiliriz: Öncelikle organizma bir virüs tarafından enfekte edilir. Ardından bu virüsün DNA’sı hücre tarafından parçalanır ve bu parçalar arasından bir ön-aralık (protospacer) geni seçilir. Seçilen bu gen çeşitli proteinler tarafından işlendikten sonra CRISPR lokusunda lider genin hemen sonrasına, yeni bir tekrar geni ile birlikte eklenir ve aralık geni adını alır. Bu da bize neden aralık genlerinin birbirinden farklı olduğunu anlatıyor; çünkü her biri farklı bir virüsten alınmış. Daha sonra bu tekrar ve aralık bölgelerinden sentezlenen CRISPR RNA’lar (crRNA) belirli Cas proteinlerinin de yardımı ile kesilir ve işlenir. İşlenmiş crRNA’lar başka Cas proteinleri ile birleşerek CRISPR ribonükleoprotein komplekslerini (crRNP) oluşturur. Hücrenin aynı virüs ile tekrar enfekte edilmesi durumunda ise virüsün DNA’sına karşılık gelen aralık dizisini taşıyan crRNP’ler virüs DNA’sını tanır ve Cas proteinlerinin nükleaz aktivitesi ile yabancı DNA parçalanır.



Cas proteinlerini de bu sisteme uygun olarak 4 gruba ayırabiliriz. İlki yeni karşılaşılan virüslerden aralık genlerinin elde edilmesini sağlayan nükleaz ve rekombinaz proteinleri. İkincisi crRNA işlenmesinde görev alan ribonükleaz enzimleri. Üçüncüsü olgun crRNA’lar ile bağ kurup crRNP oluşturulmasını sağlayan ve yabancı DNA’nın tanınmasında rol alan proteinler. Dördüncüsü de yabancı DNA’ların parçalanmasını sağlayan nükleazlar.

Araştırmalar bize CRISPR-Cas sistemlerinin temel olarak 3 gruba ayrılabileceğini gösteriyor. Tip 1, 2 ve 3 olarak adlandırılan bu sistemlerden Tip 1 ve 3 birbirlerinden filogenetik olarak oldukça uzak birçok bakteri ve arkede bulunmakla birlikte tip 2 sistemlere sadece bakterilerde rastlanmış. Ayrıca bazı plazmidlerde de CRISPR-Cas sistemlerini bulmak bize bu sistemlerin sıklıkla yatay gen transferi aracılığı ile paylaşıldığını gösteriyor. Tabi ki bu da sistemin kökenine ilişkin evrimsel çalışmaları oldukça zorlaştıran bir durum. Bir diğer ilginç nokta da Tip 3-B olarak adlandırılan sistemin DNA yerine RNA’yı hedef alması ve parçalaması.

Elbette burada akla gelen en önemli sorulardan biri şu ki nasıl oluyor da bu sistemler kendi DNA’larını parçalamıyor? Sonuçta virüsün DNA’sı ile bu DNA’dan elde edilen aralık geni birbirlerinin aynısı. Bu durumda oluşturulan crRNP hücrenin kendi aralık genini de bir yabancı DNA gibi algılayıp ve parçalamaz mı? İşte burada, daha önce bahsettiğimiz ve bir bağışıklık sisteminin temeli olan ben ve diğerleri ayrımını yapabilme yeteneği işin içine giriyor. Tip 1 ve 2 sistemlerde PAM (Protospacer Adjacent Motifs) olarak adlandırılan bir DNA dizisi, crRNP’lerin DNA parçalama aktivitesini tetikliyor. PAM dizisinin özelliği, ön-aralık dizisinden (yani işgalci DNA’nın crRNP tarafından tanınan parçası) hemen önce gelmesidir. İkinci bir özelliği ise bariz bir şekilde CRISPR lokusundaki tekrar dizilerinden farklı olmasıdır. Bunu gözünüzde canlandırmaya çalışırsanız bu hücrenin nasıl ben ve diğerleri ayrımını yaptığını fark edeceksiniz. Hücrenin kendi DNA’sında bir tekrar dizisi ve hemen ardından gelen aralık dizisi var. Yabancı DNA’da ise PAM dizisi ve hemen ardından gelen ön-aralık dizisi var (terimler aklınızı karıştırmasın, ön-aralık dizisi ile aralık dizisi birbirinin aynısıdır). PAM dizisine bağlanmak da crRNP’lerin nükleaz aktivitesini tetiklerken tekrar dizisine bağlanmak herhangi bir etki yaratmıyor. Tip 3 sistemlerde ise durum biraz farklı. Bu sistemlerde PAM motifleri kullanılmamakta fakat tekrar dizisine bağlanmak crRNP’nin inaktif hale gelmesine sebep olmaktadır. 

Moleküler biyoloji ve özellikle genetik mühendislik tekniklerine aşina olan okurlar belki de CRISPR sisteminin sağlayabileceği avantajı fark etmiştir bile. Bunu çok daha önceden fark eden Dr. Jennifer Doudna ve ekibi 2012 yılında yayınladıkları bir dizi makale ile bu sistemler üzerinden geliştirdikleri tekniği nasıl genetik mühendisliğinde kullanabileceklerini gösterdiler. İşin güzelliği ise insanı hayrete düşürecek basitliğinde yatıyor. CRISPR sisteminin özelliği belirli bir DNA dizisi üzerinde işlemesidir. Bu da demektir ki herhangi bir DNA’yı yüksek hassaslıkta ve doğrulukta kesebilmemiz için bize gereken tek şey o DNA’nın baz dizisi ve hücre içinde crRNP oluşturabilecek, aktif bir Cas nükleaz proteini. DNA’nın baz dizisine karşılık gelen bir crRNA oluşturuyoruz, bu crRNAyı Cas proteini ile birleştiriyoruz ve hücrenin içine salıyoruz. Bundan sonra tek yapmamız gereken oluşturduğumuz crRNP kompleksinin gidip DNA’yı bizim belirlediğimiz yerden kesmesini beklemek. Bu sayede doğuştan gelen genetik hastalıklardan kansere ve AIDS’e kadar birçok hastalığın tedavisinde kullanılabilecek bir yol açmış oluyoruz. Birçok araştırmacı tarafından “insanın ağzını açık bırakacak” bir teknik olarak tanımlanan bu teknik şu zamana kadar insan kök hücreleri dâhil birçok canlıda denendi ve oldukça olumlu sonuçlar aldı. Hatta Science dergisi 2013 yılının en önemli bilimsel gelişmelerinden biri olarak bu tekniğin geliştirilmesini seçti. Elbette henüz tekniğin optimize edilmesi adına çok çalışmalar yapılmalı ancak yine de bu çok daha başarılı tedavilerin yakın olduğunu hissetmemizi engellemiyor.

Yazının sonunda Carl Sagan’ın beni çok etkileyen bir örneğinden bahsetmek istiyorum. Karanlık Bir Dünya’da Bilimin Mum Işığı kitabını okuyanlar aşinadır, bugünkü bilgi teknolojimizin ve paylaşımının temelini oluşturan, cep telefonlarımızdan uzay teleskoplarına kadar birçok aletin çalışmasına olanak tanıyan elektromanyetik dalgalar Maxwell’in çalışmaları ile çok daha açık bir şekilde anlaşılmıştır. Fakat Maxwell’in elektromanyetik dalgalar üzerine çalışırken bir cep telefonu düşlediği ile ilgili hiçbir kanıtımız yok. Lafın özü, temel bilim çalışmalarının bize ne gibi olanaklar sağlayacağını her zaman önceden kestiremeyebiliriz. Hazırlıklı olalım ki 10 yıl önce arkelerin edinilmiş bağışıklık sistemi üzerine çalışan ve belki de önemsenmeyen bir biliminsanı 10 yıl sonra birçok genetik hastalığa çare olabilecek bir teknik ile çıkageldiğinde şaşırmayalım.

Yazan: Onur Özer (Evrim Ağacı)

Kaynaklar ve İleri Okuma:
6 Yorum